微柱凝胶技术

一。何为微柱凝胶技术

微 柱凝胶技术是液相技术与固相技术的巧妙组合，是凝胶过滤技术、离心技术、红细胞凝集试验技术（特异性抗体抗原反应）的完美结合。通过对凝胶种类的选择和凝胶浓度的调节来控制分子筛孔径大小，使分子筛只允许游离红细胞通过，从而达到分辩凝集红细胞和非凝集红细胞的目的。微柱凝胶技术是目前最易大规模推广、最适于常规试验的血型血清学试验技术。
     二。微柱凝胶种类
      1. 中性胶（又称空白胶，仅含有葡聚糖凝胶）：用做检测IgM抗体与相应抗原红细胞的反应；
      2. 特异性胶（如加入抗-A、抗-B、抗-D等特异性抗体的凝胶）：利用包被的抗体检测相应抗原；
      3. 抗人球蛋白胶（包被了单特异性或多特异性抗人球蛋白试剂的凝胶）：用于检测IgG抗体与相应抗原红细胞的反应。
     三。微柱凝胶技术反应原理当抗原抗体反应时红细胞发生凝集（包括已致敏的红细胞通过抗人球蛋白的桥联作用发生的凝集），在一定的离心力作用下，凝集的红细胞不能通过凝胶间隙而留在凝胶管上层或分散在凝胶管中，此为阳性反应；而未凝集的红细胞在离心力的作用下可通过凝胶间隙而沉积于凝胶管的底部，此为阴性反应。
     四。微柱凝胶卡的设计
     1. 每卡有6孔或8孔不等，国内产品目前均为6孔；
     2. 每孔根据不同用途，采用不同设计。每孔加入的可以是中性胶、特异性胶或抗人球蛋白胶；
     3. 每孔有反应腔和凝胶两部分。
     五。微柱凝胶技术的用途
     1. 患者血型鉴定
     2. 患者输血前或孕妇抗体筛选
     3. 抗体特异性鉴定
     4. 交叉配血试验
     5. 药物性免疫性溶血性贫血及自身免疫性溶血性贫血等疾病免疫性血清学检测
     六。微柱凝胶卡离心时间及离心转速设计

不同厂家根据使用的凝胶种类、浓度、仪器设备及实验结果而采用不同的设计方案，每家的方案无疑是针对自己的产品所设计的最佳离心时间和转速。我公司的是：900rpm/min，离心2min ，1500rpm/min，离心3min ，两个不同转速间自动变速。
     七。微柱凝胶技术结果判读
     4+ 离心后，红细胞成线条状停留在凝胶管表层；
     3+ 离心后，大部分红细胞停留在凝胶管表面，少部分降至凝胶管中上部；
     2+ 离心后，大部分红细胞位于凝胶管中部，少部分位于凝胶管中上部；
     1+ 离心后，红细胞位于凝胶管下部近底部处；
     ± 与同卡内阴性对照做比对，如与阴性对照有差别，凝胶卡判为±，为弱反应；如与阴性结果一致，可判为阴性；
     0   离心后，红细胞完全沉积于凝胶管底部；
     M  为混合反应表示，指有部分红细胞居于凝胶管表面或凝胶管内，而另一部分红细胞则沉积于管底部；
     H  为溶血反应表示，指反应腔内液体呈清澈透明红色，表示出现红细胞溶血。完全溶血为凝胶管内完全无凝集及未凝集红细胞存在；不完全溶血指仍有残留的红细胞存在于凝胶管表面、中间或底部。 
     八。为什么微柱凝胶法不用洗涤红细胞？

由于凝胶管中的抗人球蛋白与反应腔中的血清处于两相中，又加之互不扩散，因而互不接触，不存在血清球蛋白中和消耗抗人球蛋白的问题。当离心时，相邻的单红细胞免疫复合物（被IgG抗体致敏的红细胞）在通过凝胶管时因抗人球蛋白的桥联作用而出现凝集，而血清中的剩余球蛋白却因为在相同的离心力下仍旧停留在反应腔中，不能和抗人球蛋白结合。红细胞沉降所需离心力一般不足100g,而血清蛋白分子沉降的离心力至少需要3000g。
     九。微柱凝胶技术中假阳性的原因及处理方法
     1. 血清中高纤维蛋白引起的红细胞沉降受阻。血样经重新离心及红细胞洗涤后重新试验。
     2. 血清或红细胞被细菌污染，也会产生假阳性结果。取新鲜血标本重新试验。
     3. 破碎红细胞的细胞膜浮着于凝胶管表面或中间。取新鲜血标本重新试验。
     4. 试验时温度过低，凝胶颗粒活动性减少，致单个红细胞穿过凝胶颗粒时发生困难。将微柱凝胶卡经适当时间复温后重新试验或将试验置37℃进行。
     5. 红细胞表面有补体致敏，在使用多特异性抗人球蛋白试剂进行试验时会出现阳性结果。建议使用抗-IgG抗人球蛋白试剂重新试验。
     6. 假凝集、自身凝集都会使微柱凝胶试验中出现假阳性。假凝集由某些疾病、使用某些药物、输注某些高渗或高蛋白溶液引起。须将红细胞用生理盐水洗涤后重新试验，自身凝集多为冷自身抗体引起，通过加温处理或在37℃进行试验可以避免自身凝集干扰。也可用DTT或2-ME将红细胞处理（破坏引起自身凝集的IgM抗体）后重新试验。
     7. 离心机离心转速显示错误（实际转速低于显示转速），离心机转子在离心时发生位置偏移。离心机要定期测速调速，离心前转子要固定到位
     十。微柱凝胶技术中假阴性的原因及处理方法
      1. 抗体抗原比例不当，抗体过剩或抗原过剩导致前带现象或后带现象的发生。严格按规程要求操作可杜绝此类现象发生。
      2. 受检者血清抗体太少太弱，或红细胞抗原太少太弱。原因可能是血标本放置时间过久，或存放不当，或受检者抗原抗体本身就很弱（遗传原因，如亚型；疾病原因，如某些白血病患者）。取新鲜血标本重新试验，至于受检者本身抗体抗原很弱的病例，根据具体情况，可采用正反定型、亚型鉴定、吸收释放试验、血型物质测定及家庭情况调查等方法加以鉴别。
      3. 抗体试剂问题，存放过久或存放不当导致抗体效价失效。更换抗体试剂重新试验，并增加对照试验。
      4. 操作错误，未加入或加错抗体试剂，加入反应物后孵育时间太短或根本未经孵育。杜绝方法：操作要认真，核对要仔细，严格按操作程序进行操作。
     十一。使用微柱凝胶技术注意事项
      1. 微柱凝胶卡要垂直平稳放于18℃～25℃条件下，避免重物挤压，避免阳光直射，远离热源，并保持一定的湿度。防止温度过高，湿度过低导致凝胶脱水、干涸。也要防止温度过低，导致凝胶颗粒浓缩变形，柔滑度变低，凝胶颗粒间隙变小，使单个红细胞的通过受阻，影响试验结果；
      2. 试验前将微柱凝胶卡置专用离心机上离心数分钟，使因搬运、震动而移动的凝面恢复至水平位置；
      3. 向反应腔内加样必须先加红细胞后再加抗体试剂（血清或分型抗体试剂）；
      4. 红细胞不用洗涤，可直接从红细胞层吸取一定量的压积红细胞，用LISS溶液或生理盐水稀释液配制成所需浓度的悬液；
      5. 用于配制红细胞悬液的稀释液在冰箱取出后必须先行复温，再行配制红细胞悬液，防止冷凝集现象发生，影响试验结果；
      6. 加样量和红细胞悬液浓度应严格按操作说明书执行；
      7. 加样时一定要加至微柱凝胶卡反应腔内。目的是避免抗体与抗原不能充分结合，也为了防止气泡形成，影响试验结果；
      8. 出现干胶、气泡或封条损坏现象时，不得再继续使用；
      9. 该技术一般不用于抗体效价测定。
     十二。微柱凝胶技术的特点：
      1. 简便快速：红细胞不用洗涤，简化了试验程序，缩短了试验时间。孵育时间较试管法起码缩短了15分钟；
      2. 准确：结果清晰明了，重复性好；
      3. 敏感：敏感性高于试管法10倍左右，且恰到好处，很少有假阳性出现；
      4. 标本用量少：标本用量为试管法的1/10～1/5，有利于新生儿及某些标本难采集的患者的血标本的检测；
      5. 操作加样标准化：试验全过程及结果判读均易于规范化、标准化；
      6. 生物安全防护好：操作简便、规范，大大减少了操作者与血液标本接触的机会，降低了医疗源性传染的危险；
      7. 保存时间长：检测完后反应格局在室温条件下可保存数天，甚至数周不发生变化。还可将其拍照长期保存。
     十三。微柱凝胶试验技术分类
      1. 微柱凝胶直接血凝试验：是指在含有中性胶的微柱凝胶卡反应腔内加入红细胞抗体试剂（或血清）和红细胞后，直接离心观察判定结果。如ABO血型鉴定，采用IgM抗体对RhD及其他抗原的检测；
      2. 微柱凝胶抗人球蛋白试验：一是指将受检者红细胞洗涤后加入微柱凝胶卡反应腔内，直接离心观察判定结果。此为直接抗人球蛋白试验；二是指在含有抗人球蛋白胶的微柱凝胶卡反应腔内加入已知特异性IgG抗体（或已知抗原红细胞）及受检红细胞（或受检血清），按规定37℃孵育一定时间后，离心观察判定结果，此为间接抗人球蛋白试验；
     3. 微柱凝胶间接血凝试验：是指红细胞膜事先包被有抗原或抗体后加入含抗人球蛋白